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    大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實驗——酶消化法

    發(fā)布時間: 2021-12-05  點擊次數(shù): 1394次

    材料與儀器

    小鼠
    酒精 解剖液 胰蛋白酶 DMEM F12 B27 阿糖胞苷培養(yǎng)液
    培養(yǎng)箱

    步驟


    一、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟

    1.  于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min,解剖出完整鼠腦。

    2.  預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗,用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊。

    3.  移入培養(yǎng)皿中,吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml,37℃培養(yǎng)箱中消化30 min。

    4.  將皮層組織碎塊移入離心管,棄去剩余消化液,用接種液洗3次,每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底,棄去上清液。

    5.  最后再用接種液1 ml混懸,反復(fù)吹打(巴氏吸管)混懸液中組織塊,力度適中,至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用。

    6.  加入1ml接種液后再次吹打,如此反復(fù)3-4次,組織塊逐漸消化后,棄去最終殘塊。

    7.  收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中,以接種液重新懸浮細(xì)胞,細(xì)胞記數(shù);接種1x107個細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中。

    8.  培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后,換全培養(yǎng)液(DMEM/F12+2%B27)培養(yǎng)3d,觀察神經(jīng)元生長狀況。

    9.  換用阿糖胞苷培養(yǎng)液、  每隔3d換全培養(yǎng)液1次,每次換半液。

    二、神經(jīng)元免疫化學(xué)鑒定

    1.  4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,PBS洗滌3次。

    2.  加入無水甲醇:30%雙氧水(5:1)處理30 min,PBS洗滌3次。

    3.  加入5%羊血清封閉20 min,棄去多余液體。

    4.  加入Rabbit Anti-NSE(1:100)(神經(jīng)元特異性烯醇化酶),培養(yǎng)箱中孵育2-4 h,PBS洗滌3次。

    6.  加入DAPI染液(1:40),室溫放置5-10 min;PBS洗滌3次。

    7.  熒光顯微鏡觀察。 

    三、結(jié)果      


    圖1: 剛接種時細(xì)胞圖

    圖2: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)1d后

    圖3: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)2d后

    圖4: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)3d后

    圖5: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)4d后


    圖6: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)5d后


    圖7: 剛接種時細(xì)胞圖培養(yǎng)6d后


    圖8:第7d免疫鑒定圖


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